HLAとは?

HLAとは?

赤血球にはA型、B型、AB型、O型などの血液型があり、輸血の際には血液型を一致させないといけません。同様に白血球をはじめとする全身の細胞にはヒト白血球抗原(HLA:Human Leucocyte Antigen)と言われる型があり、移植には患者さんとドナーさんのHLA型の一致する割合が関係してきます。
造血幹細胞移植ではHLA型のA座、B座、C座、DR座という4座(8抗原)の一致する割合が重要だとされています。HLA型は両親から各座半分ずつを遺伝的に受け継ぐため、兄弟姉妹の間ではHLA型が完全にあったドナーが4分の1の確率で見つかりますが、多くの患者さんは家族内にHLA型が適合するドナーを持っていません。 また、非血縁者間では、数百から数万分の1の確率でしか一致しません。

1.座(locus:遺伝子座)

遺伝子座(いでんしざ)とは染色体やゲノムにおける遺伝子の位置(領域)をいいます。HLAの場合は、第6染色体の短腕に存在するMHC領域に数多くのHLA遺伝子座が存在しており、造血および臓器の移植時にHLA検査を行っているHLA-A, B, DR座には多くのHLAタイプが確認されています。

2.アリル(allele:対立遺伝子)

対立遺伝子(たいりついでんし)とは、相同な遺伝子座を占める遺伝子に複数の種類がある場合の個々の遺伝子のことを意味します。
ヒトをはじめ2倍体の生物は、それぞれの遺伝子座には父母に由来する2つの対立遺伝子を持っています。HLA-A遺伝子座の場合、HLA-A2抗原に相関する対立遺伝子として、HLA-A*02:01、HLA-A*02:05、HLA-A*02:06、HLA-A*02:07等数多くの対立遺伝子が存在しており、骨髄移植では、これら対立遺伝子の異同が移植成績に影響を及ぼしています。

3.アリルに付記している接尾語

アリル名の末尾に表1のような接尾語がつく場合があります。
表1 アリルに付記する接尾語
意味
HLA-A*24:09N 遺伝子は存在するが、HLA分子が完全な状態で合成することができないアリル。Nullの頭文字である「N」を付記する。
HLA-A*30:14L 細胞表面のHLA分子が著しく少ないアリル。Lowの頭文字である「L」を付記する。
HLA-A*44:02:01:02S 発現しているHLA分子が可溶性の分泌分子として存在している。Secretedの頭文字である「S」を付記する。
HLA-A*32:11Q 細胞表面にHLA分子が発現されているか明確でない。Questionableの頭文字「Q」を付記する。
その他にC(Cytoplasm)とA(Aberrant)が接尾語として提唱されており、「C」は細胞質内にアリル産物が存在することを示し、「A」はタンパク質が表現されるかどうか疑問があることを示しています。2010年4月の時点で「C」と「A」が付記されたアリルは存在していません。

4.DNA型

日本骨髄バンクでは、登録時のHLA検査として蛍光ビーズ法(PCR-rSSO法)によるDNAタイピングを行っています。この方法では、特定のアリルを決定することが出来ず、HLA-A*31:01/31:02等のような、複数のHLAアリルの可能性がある検査結果になります(表2:「蛍光ビーズ法(PCR-rSSO法)での検査結果と各結果表記法」を参 照)。

5.アリルコード(表2参照)

蛍光ビーズ法(PCR-rSSO法)またはSBT法で行ったDNAタイピングの結果で、1つのアリルを特定できない場合、アメリカ骨髄バンク(NMDP)で使用しているアリルコード体系を用いて結果を表示します。

6.参考アリル(表2参照)

HLAタイピング結果で複数のアリルの可能性がある場合、日本骨髄バンク登録者で最も可能性が高いアリルを意味します。

7.検索用抗原




表2 蛍光ビーズ法(PCR-rSSO法)での検査結果と各結果表記法
結果表記法 HLA-A HLA-B HLA-DRB1
検査結果 A*31:01/31:02 B*15:27/15:32/15:85 DRB1*11:01/11:04/11:05/11:06
アリルコード(NMDP) A*31:AB B*15:BFHB DRB1*11:EU
参考アリル A*31:01 B*15:27 DRB1*11:01
検索用抗原 A31 B62 DR11

HLAの検査法

1.血清学的検査

HLAの特異性が既知の抗血清とリンパ球上のHLA抗原との反応性によりHLA型を決定する検査法で、主にリンパ球細胞障害試験(LCT法)で行われます。

LCT法は、HLA抗血清とリンパ球を混和し、更にウサギ補体を加え反応させます。HLA抗血清とリンパ球上のHLA抗原が結合した場合、補体反応が活性化され、リンパ球膜が壊されます。膜が壊れたリンパ球(死細胞)と壊れていないリンパ球(生細胞)の割合から、各抗血清との反応性(陽性と陰性)を判定し、反応パターンからHLA型を判定します。

2.DNA型検査(下表参照)

DNAを用いてHLAの対立遺伝子(アリル)を決定する検査法(DNAタイピング)には複数の方法があります。

  PCR-SSO PCR-RFLP PCR-SSP PCR-SSCP PCR-SBT
原理 ブロードとの相補的な結合 制限酵素により塩基配列に特異的な切断 プライマーによる塩基配列に特異的な増幅 一本鎖DNAの立体構造の形成 塩基配列の決定
検出 標識したプローブとのハイブリタイゼーション 制限酵素による酵素反応 塩基配列に特異的なプライマーによる遺伝子増幅 熱やアルカリ処理による一本鎖DNAの変性 ジデオキシヌクレオチドによるシーケンス反応
判定 結合したプローブの発色または発行パターンから判定 ゲル電気泳動による酵素切断の有無のパターンから判定 ゲル電気泳動による増幅の有無のパターンから判定 ゲル電気泳動パターンにより判定(標準DNAと比較) ゲル電気泳動から直接塩基配列を決定し判定
精度
(要因)
低~高精度(プローブ数) 低~高精度(制限酵素数) 低~高精度(プライマー数) 中~高精度(標準DNA) 高精度
簡便性 やや煩雑 簡便 簡便 やや煩雑 煩雑
処理数 多い 少ない 少ない 少ない 少ない

3.蛍光ビーズ法(PCR-rSSO法 reverse -Sequence Specific Oligonucleotide)

【検査法】

①PCR
ポリメラーゼ連鎖反応(polymerase chain reaction, PCR)をし、目的のHLA遺伝子を増やします。



②アルカリ変性
アルカリ性の条件の下で、2本鎖DNAを1本鎖にします。



③ハイブリダイゼーションと標識
プローブが結合しているポリスチレンビーズに1本鎖にしたDNAをハイブリダイゼーションさせ、同時にビオチンにPE標識をしたストレプトアビジンを結合させます。



④測定
Luminexで測定します。




【結果の管理】
  • HLAタイピング結果として、1つのアリルを決定することが可能な場合もあるが、ほとんどの場合、複数のアリルの可能性があります。
  • ドナー登録者のタイピング結果を全てアリル情報で管理することが困難であることから、複数のアリルの可能性がある場合は、アリルコードを使用し管理・表記します。

※蛍光ビーズ
ポリスチレンビーズを2色(赤とオレンジ)の蛍光色素をいろんな濃度に組合わせ染色し、色分けしたもの

HLA検査と結果の表記

HLAタイピング結果から1つのアリルが決定出来ない場合、複数のアリルをアリルコードとして管理し、表記を行っています。
以下にタイピング結果とアリルコードの関連について説明します。

蛍光ビーズ法

SBT法

骨髄バンクにおけるHLA適合度の評価

造血幹細胞適合検索サービスでは、患者さんとドナー登録者のHLA型の適合度が高い順に表示しています。HLA適合度は、これまで行われた骨髄移植の成績に基づいて評価され、良い移 植成績が得られるように患者さんとドナー登録者のHLA型から評価します。

適合検索条件

患者さんとHLA-A座,B座,DR座の5抗原以上が一致しているドナー登録者が、HLA適合の対象者となります。適合するドナー登録者にHLA-C座の情報が登録されている場合は、C座も適合度に反映されます。

HLA適合度

患者さんとドナー登録者のHLA適合度はA座-B座-C座-DR座もしくはA座-B座-DR座で評価されます。

①患者さんもしくはドナー登録者のHLA型表記が抗原型の場合

HLA型が抗原型で登録されている場合は、適合する抗原型が多いほど適合度が高くなります。その適合度の優先順位は[A座またはB座]>DR座>C座の順になっています。

②患者さんもしくはドナー登録者のHLA型表記がアリル型の場合

HLA型がアリル型で登録されている場合は、適合する抗原型の数もしくはアリル型の数が多いほど適合度が高くなります。
また、抗原型及びアリル型の適合数が同じである場合、ミスマッチしている抗原型もしくはアリル型で優先順位が異なります。適合度の優先順位は[A座またはB座の抗原型]>DR座の抗原型>[A座、B座、C座、DR座の抗原型もしくはC座のアリル型]の順になっています。

HLAアリル型適合度評価はHLA型のタイピング方法によって異なり、「アリル型」もしくは「アリルコード」と表記が区分されます。その場合、適合度は[アリル型]>[アリルコード]となります。


表1. アリル型適合例
この表では、患者さんのHLAアリルを入力した場合を示しています。
患者タイプ 患者A A*24:02 患者B A*24:BC(24:02/24:03)
ドナー登録者タイプ アリル適合 A*24:02 --
アリルコード適合 A*24:BC(24:02/24:03) A*24:02 A*24:03 A*24:BC(24:02/24:03) A*24:DB(24:03/24:10)
アリル不適合 A*24:03 A*24:DB(24:03/24:10) A*24:20 A*24:AAB(24:08/24:13)
赤字:適合アリル

HLA-A,B,DRB1の評価例

HLA-A, B, DRB1座の抗原およびアリルの適合パターンを下へ示しています。

表2. 適合検索結果例(HLA適合度別評価点の例)
ドナー
HLA型
患者HLA型 適合度
A*24:02,A*33:03
(A24,A33)
B*52:01,B*44:03
(B52,B44)
DRB1*15:02,DRB1*13:02
(DR15,DR13)
1 A*24:02,A*33:03 B*52:01,B*44:03 DRB1*15:02,DRB1*13:02 アリル適合
2 A*24:BC/A*33:03
(A*24:BC 24:02/24:03)
B*52:01,B*44:03 DRB1*15:AB,DRB1*13:02
(DRB1*15AB 1501/1502)
アリル適合&
アリルコード適合
3 A24,A33 B52,B44 DRB1*15:02,DRB1*13:02 アリル適合&
抗原適合
4 A24,A33 B52,B44 DR2,DR6 抗原適合
5 A*24:20,A*33:03 B*52:01,B*44:03 DRB1*15:02,DRB1*13:02 アリル不適合
6 A*24:20,A33:03 B*52:BC,B*44:03
(B*52:BC 52:02/52:03)
DRB1*15:02,DRB1*13:02
7 A*24:20,A*33:03 B*52:01,B*44:02 DRB1*15:01,DRB1*13:01

注:アリル適合=二重線(例:A*24:02)、アリルコード適合=下線 (例:A*24:02)、抗原適合=点線(例:A24)
  アリル不一致=太字(例:A*24:20)

さい帯血バンクにおけるHLA適合度の評価



参考サイト